D. Wilfingseder, H. Stoiber
Institut für Hygiene und Sozialmedizin und
Ludwig Boltzmann-Institut für AIDS-Forschung, Innsbruck
(Vorstand: o. Univ.-Prof. Dr. M.P. Dierich)

• Schlüsselwörter
• Zusammenfassung
• Key-words
• Summary
• Definition
• Real-time PCR
• Real-time PCR und interkalierende Farbstoffe
• Spezifische Hybridisierungssonden
• Ausblick
• Literatur

Die real-time quantitative PCR oder auch quantitative Echtzeit-PCR stellt eine Weiterentwicklung der Mitte der achtziger Jahre von K.B. Mullis entwickelten Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) dar [1]. Die PCR ist eine sehr schnelle und sensitive Methode zur In-vitro-Amplifizierung spezifischer DNA-Abschnitte und ermöglicht somit die Detektion kleinster DNA-Mengen. Die PCR ist ein sehr wichtiges Werkzeug der modernen Molekularbiologie geworden, da sie im Bereich der Sequenzanalyse, bei Genexpressionsstudien und bei der Genklonierung eingesetzt wird [2, 3]. Das Prinzip der PCR-Reaktion basiert auf der enzymatischen Vermehrung eines bestimmten DNA-Abschnittes, der zwischen zwei Startersequenzen, den so genannten Primern, liegt. Die Basenabfolge der beiden Primer muss komplementär zur amplifizierenden DNA-Sequenz sein. Weiters sollten die Primer eine Länge von 18 bis 30 Basen haben, einen G/C-Gehalt zwischen 20-80%, sowie eine Schmelztemperatur (Tm) von ca. 60°C. Bei der Primerauswahl sollten Poly(T)-Bereiche, Haarnadelstrukturen und auch
3´-Komplementarität vermieden werden, da es sonst zu unspezifischen Bindungen oder Primerdimerbildung kommen könnte. Binden die Primer an die komplementären DNA-Abschnitte, katalysiert das Enzym DNA-Polymerase die In-vitro-DNA-Synthese. Die DNA-Synthese erfolgt im Wesentlichen in drei Schritten: Jeder Zyklus besteht aus 1) einem Denaturierungsschritt bei 95°C, um die beiden DNA-Stränge voneinander zu trennen, 2) einem Hybridisierungsschritt, in dem die beiden Primer an den jeweils komplementären Strang binden, und 3) einem Syntheseschritt, währenddessen der zwischen den Primern liegende DNA-Abschnitt mithilfe der DNA-Polymerase und der im Reaktionsmix vorhandenen Desoxyribonucleotide selektiv synthetisiert wird. Während jedes PCR-Zyklus sollte sich demnach die Menge der spezifischen DNA-Abschnitte verdoppeln, die im nächsten Zyklus wiederum als Template für die Amplifikationsreaktion dient. Theoretisch würde somit die Menge der Zielsequenz während der PCR-Reaktion exponentiell zunehmen. In der Praxis wird jedoch eine ca. 70-80%ige Effizienz der PCR erreicht, da die Bedingungen für eine exponentielle Amplifizierung des Zielproduktes sowohl am Anfang wie auch am Ende der Reaktion nicht optimal sind. Eine typische PCR-Reaktion verläuft in den ersten Zyklen, bei denen die Templatemenge noch sehr gering ist, linear, steigt anschließend exponentiell an und erreicht in der letzten Phase der Reaktion ein Plateau, da die Enzymaktivität nach einer bestimmten Zeit nachlässt und auch die amplifizierten DNA-Abschnitte teilweise nicht mehr mit den Oligonucleotid-Primern, sondern untereinander hybridisieren. Aufgrund dieser PCR-Reaktionskinetik ist es schwierig, Aussagen über die Ausgangs-DNA-Mengen zu treffen. In vielen Fällen ist jedoch eine Quantifizierung der Ausgangstemplatemenge nötig, z.B. bei Virusquantifizierung oder Überprüfung von antibakteriellen/antiviralen Therapieversuchen. Dies führte zur Entwicklung von der Endpunktmessung zur real-time quantitative PCR. Erste Erfolge, die Ausgangsmenge zu quantifizieren, wurden 1990 durch die quantitative kompetitive PCR erzielt [4]. Bei dieser Methode werden zwei Templates gleichzeitig in einer Reaktion eingesetzt, wobei es sich bei einem Template um einen internen Standard bekannter Kopienzahl und beinahe identischer Nucleotidsequenz handelt. Nach Gelanalyse können die beiden PCR-Produkte mittels Densitometer oder Szintillationszählung der eingebauten, radioaktiv markierten Nucleotidmengen verglichen und so die DNA-Menge der unbekannten Probe bestimmt werden.

Die Grundlage für die heute angewandte real-time quantitative PCR wurde 1992 durch Higuchi et al. geschaffen [5]. Higuchi et al. statteten die PCR-Maschine mit einer UV-Lampe und CCD-Kamera aus und fügten der PCR-Reaktion Ethidiumbromid (EtBr) zu. EtBr fluoresziert, wenn es in doppelsträngige DNA eingebaut und durch UV-Licht angeregt wird. So konnte die Fluoreszenz gemessen und die Konzentration der Ziel-DNA bestimmt werden [6]. Die Methode wird auch heute noch angewandt, jedoch unter Verwendung anderer Farbstoffe. Bei der real-time PCR wird ein fluoreszierender Reporterfarbstoff verwendet, um die Reaktion verfolgen zu können. Dieser Reporter kann von nicht-spezifischer Natur sein oder spezifisch mit der Ziel-DNA interagieren. In beiden Fällen steigt die Fluoreszenz proportional mit der Produktmenge an. Real-time Detektionssysteme bestehen im Prinzip aus einem PCR-Cycler sowie einem optischen Detektionsmodul, über das die mit der Produktzunahme ansteigenden Fluoreszenzwerte online nach jedem Zyklus gemessen werden. Die Auswertung und Quantifizierung erfolgt mittels der geeigneten Computersoftware. Die Fluorophore werden – je nach System – mit Halogen-, LED- oder Laserlicht angeregt.

Die Quantifizierung der PCR basiert bei allen Systemen auf der Berechnung des Fluoreszenz-Schwellenwertes, dem so genannten Threshold Cycle oder CT-Wert. Der CT-Wert ist jener PCR-Zyklus, bei dem die Reporterfluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt. Am Anfang der PCR-Reaktion wird nur die Basis- oder Hintergrundfluoreszenz gemessen, da die Reporterfluoreszenz aufgrund der geringen Templatekonzentration im Reaktionsgefäß während der ersten PCR-Zyklen normalerweise nicht detektierbar ist. Die Quantifizierung der DNA-Menge beruht nicht auf absoluten Mengen an PCR-Produkt, sondern auf der Kinetik der PCR-Reaktion. Dafür nimmt man als Richtlinie den CT-Wert, da zu diesem Zeitpunkt die Amplifikation exponentiell ist und es in dieser Phase der PCR-Reaktion keine limitierenden Faktoren, wie Primer- oder Nucleotidmangel, nachlassende Enzymaktivität oder Inhibition der PCR-Reaktion durch Generation bestimmter Produkte, gibt. Parallel dazu werden in jedem PCR-Lauf bekannte Templatemengen amplifiziert, sodass man vergleichen kann, welche Templatemenge man bei welchem CT-Wert erhält. Daraus lässt sich eine Standardkurve erstellen, anhand derer man aus einem bestimmten CT-Wert auf eine Templatekonzentration schließen kann. Ein typischer real-time PCR-Run und die daraus resultierende Standardkurve ist in Abb. 1 dargestellt.

Abbildung 1: Datenanalyse und Standardkurve: Die Quantifizierung unbekannter DNA-Ausgangsmengen beruht auf ermittelten CT-Werten von Standards bekannter Konzentrationen. In diesem Beispiel wurden bekannte und unbekannte Konzentrationen von Bacillus anthracis mittels real-time quantitative PCR amplifiziert und anschließend mithilfe der daraus resultierenden Standardkurve quantifiziert. Der Schwellenwert, bei dem die Reporterfluoreszenz die Basisfluoreszenz deutlich übersteigt, (Y-Achse) wird gegen den log der Ausgangs-DNA-Menge (X-Achse) aufgetragen.

Wie bereits erwähnt, verwendet man heutzutage andere interkalierende Farbstoffe als EtBr, die ein besseres Signal-Hintergrund-Verhältnis liefern, hier vor allem SYBR®-Green I (Molecular Probes, Portland, Oregon). Dieser Fluoreszenzfarbstoff lagert sich – wie EtBr – unspezifisch in Doppelstrang-DNA ein (Abb. 2a). Dadurch kommt es mit fortschreitender PCR-Reaktion zu einem Fluoreszenzanstieg. Der Vorteil von SYBR®-Green I ist die universelle Verwendbarkeit, da es unspezifisch eingebaut wird und in jede beliebige PCR-Reaktion eingesetzt werden kann, sowie die hohe Signalstärke, da jedes DNA-Molekül mehrere Fluoreszenzmoleküle bindet. Es fehlt jedoch eine spezifische Bindung des Fluorophors an die zu amplifizierende Ziel-DNA, sodass eine Unterscheidung zwischen korrektem Produkt und Artefakt oder Primerdimeren, die während der PCR-Reaktion auch einen Fluoreszenzanstieg verursachen können, nicht möglich ist. Eine Differenzierung zwischen spezifischem Produkt und Primerdimeren beziehungsweise auch Mutationsanalysen sind im Anschluss an den PCR-Run mithilfe einer Schmelzkurvenanalyse möglich. Dabei kommt es durch schrittweisen Temperaturanstieg zu einer Auftrennung der DNA-Doppelstränge entsprechend ihrer jeweiligen Schmelzpunkte in ihre Einzelstränge. Die daraus resultierende Fluoreszenzabnahme wird aufgezeichnet. Aufgrund der Schmelztemperaturen kann man zwischen spezifischen Produkten und Primerdimeren oder Mutationen unterscheiden, da Primerdimere/Mu-tationen bei geringeren Temperaturen schmelzen als die spezifischen, größeren PCR-Produkte (Abb. 2b).

Abbildung 2: SYBR®-Green I (SG I)-Reaktion und Schmelzkurvenanalyse: a) Nach Einbau in doppelsträngige DNA fluoresziert SG I, es kommt zu einem Fluoreszenzanstieg, der direkt proportional zur Produktmenge ist. b) Die Unterscheidung der mit SG I markierten PCR-Produkte mittels Schmelzkurvenanalyse erfolgt im Anschluss an die PCR-Reaktion. Kleinere Fragmente (Primerdimere, Mutationen) haben eine niedrigere Tm als spezifische PCR-Produkte.

Das Problem der mangelnden Spezifität bei der Verwendung von interkalierenden Farbstoffen konnte durch Design von spezifischen Hybridisierungssonden gelöst werden.

TaqMan-Sonden
Beim TaqMan- oder auch 5´-Nuclease-Assay liegt zwischen den zwei spezifischen Oligonucleotid-Primern ein zusätzliches, fluoreszenzmarkiertes Oligonucleotid, die so genannte TaqMan-Probe. TaqMan-Proben sind Sonden, die mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff am 5´-Ende und einem intern eingebauten oder am 3´-Ende liegenden Quencher markiert sind. Die Reporterfluoreszenzemission wird bei der intakten TaqMan-Sonde durch die Nähe zum Quencher unterdrückt. Bei der Neustrangsynthese schneidet die Taq-Polymerase durch ihre 5´-, 3´-Exonucleaseaktivität die TaqMan-Probe in kleine Fragmente, wodurch es zu einer Loslösung des Reporters vom Quencher kommt und die Reporterfluoreszenz freigesetzt werden kann (Abb. 3).

Abbildung 3: TaqMan-Prinzip: Erst nach Abspaltung des Reporters (R) vom Quencher (Q) durch die 5´-, 3´-Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase wird die Reporterfluoreszenz messbar und zeigt die Synthese des spezifischen Zielstranges an.

Die Zunahme der Reporterfluoreszenz wird nach jedem Zyklus gemessen und ist wiederum proportional der Menge des DNA-Templates im Tube. Die Taq-Polymerase fragmentiert nur an die Zielsequenz gebundene TaqMan-Sonden, nicht hybridisierte Einzelstränge bleiben unbeschadet. Häufig wird Fluorescein (FAM) als Reporter und Rhodamin (TAMRA) als Quencher verwendet, für eine real-time quantitative Multiplex-PCR, bei der mehrere Zielsequenzen in einer einzelnen PCR- Reaktion nachgewiesen werden, können Farbstoffe mit unterschiedlichen Extinktions- und Emissionswellenlängen als Reporter für die nachzuweisenden Sequenzen hinzugenommen werden (Tab. 1). Anstelle von TAMRA kann auch ein „Dark Quencher“ (Dabcyl, Methylorange) genommen werden, der den Wellenlängenbereich um 585 nm für weitere Reporterfarbstoffe freigibt. Ein Dark Quencher kann im Vergleich zu TAMRA die Lichtemission des Reporterfluorophors noch besser unterdrücken, interferiert auch nicht mit der Messung und wird vor allem für die Multiplex-PCR wie auch die Markierung von Molecular Beacons eingesetzt.

Tabelle 1: Fluorophore und ihre Extinktions- und Emissionswellenlängen Fluorophor Extinktion Emission Fluorescein (FAM), SYBR® Green Hex, TET, VIC, JOE, Cy3 Tamra/Cy3 Texas Red, ROX Cy5, LC640 490 nm 530 nm 545 nm 575 nm 635 nm 530 nm 575 nm 585 nm 620 nm 680 nm

Molecular Beacons
Molecular Beacons stellen eine Weiterentwicklung der TaqMan-Sonden dar. Die Beacons sind ebenfalls spezifische Hybridisierungssonden, die eine Haarnadelstruktur mit eigenkomplementären Enden aufweisen, sodass Reporterfarbstoff und Quencher direkt benachbart zu liegen kommen. TaqMan-Proben bilden unter Umständen ungünstige Strukturen, sodass der Abstand zwischen Reporter und Quencher zu groß wird und damit die Fluoreszenzemission nicht mehr vollständig unterdrückt werden kann. Dieses Problem konnte durch die Entwicklung der Molecular Beacons gelöst werden. Die Haarnadelstruktur der Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Zielsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt (Abb. 4). Die emittierte Reporterfluoreszenz wird wiederum mittels des optischen Systems des real-time PCR-Gerätes nach jedem Zyklus detektiert.

Abbildung 4: Molecular Beacons: Bei Hybridisierung der Sonde wird die Haarnadelstruktur aufgelöst, die Reporterfluoreszenz wird dadurch messbar.

MGB-Proben®
(Applied Biosystems)
TaqMan®-minor-groove-binder (MGB)-Proben haben einen nichtfluoreszierenden Quencher am 3´-Ende, sodass das real-time Detektionssystem den emittierenden Reporterfarbstoff präziser messen kann. Weiters ist am 3´-Ende ein minor groove binder lokalisiert, der eine Erhöhung der Tm der Proben verursacht, weshalb es möglich wird, kürzere Proben zu designen. Eine kürzere Sonde ist von Vorteil, wenn man z.B. Alleldiskriminierung oder SNP-Assays durchführen möchte.

Die real-time quantitative PCR stellt ein relativ neues, grundlegendes Werkzeug der modernen Molekularbiologie dar und erlaubt Sequenz- und Mutationsanalysen, Genexpressions- und Genklonierungsstudien, Überprüfung des Virustiters unter Therapie sowie den diagnostischen Nachweis von Bakterien und Viren in kürzester Zeit und mit höchster Reproduzierbarkeit. Bei der real-time quantitativen PCR handelt es sich um eine sehr sensitive Methode, die Messungen über einen Bereich von 7 bis 8 log-Stufen und den Nachweis von kleinsten DNA-Kopienmengen zulässt. Im Bereich der real-time quantitativen PCR findet eine rasante Entwicklung statt, und Berichte, Publikationen oder Protokolle über die Einsatzmöglichkeiten der real-time quantitativen PCR häufen sich täglich. Zurzeit bieten sechs verschiedene Hersteller (ABI PRISM®-5700SDS, 7700SDS, 7900HT-SDS und 7000SDS von PE-Applied Biosystems, Light Cycler® von Roche-Diagnostics, iCycler® von BioRad, Mx4000® von Stratagene, Smart Cycler® System von Cepheid, Rotorgene® von Corbett Research) real-time PCR-Geräte an, es werden jedoch sicher weitere folgen. Die Geräte unterscheiden sich unter anderem bezüglich ihrer Bauweise, der Lichtquellen, mit denen die Fluorophore angeregt werden, und der Durchsatzraten. Von den meisten Herstellern der real-time quantitativen PCR-Geräte werden auch dazugehörige Kits und Reagenzien und allgemeine Richtlinien für die Reaktionsbedingungen angeboten, es ist bei einigen Geräten aber auch möglich, so genannte in-house Mixes zu verwenden. Natürlich kann mit den real-time PCR-Geräten auch Reverse Transcription-PCR (real-time quantitative RT-PCR) durchgeführt werden, wenn vor der PCR ein reverser Transkriptionsschritt programmiert wird. Zwei Beispiele für ein typisches real-time quantitative RT-PCR-Protokoll und Thermoprotokoll sind in Tabelle 2 dargestellt (AB-Kit, Stratagene-Kit). Somit stellt die real-time quantitative PCR eine relativ einfache Methode, mit der man schnell sehr präzise Ergebnisse erzielen kann, dar.

Tabelle 2: Beispiele für SYBR®Green- (AppBiosystems) und TaqMan®-Protokolle (Stratagene) Reagenzien Konzentration/50 µl Reaktion Thermoprofil SYBR® Green-PCR (AB): Schritt 1 95°C 10 min 50 Zyklen 95°C 60°C 15 sec 1 min Schritt 2 Schmelzkurve! cDNA x 2 x SybrGreen Mastermix 1 x Primer I 10 µM/ml 200 nM Primer II 10 µM/ml 200 nM Fluorogenic Calibration Dye 1µM/µl 10 nM A.D. y-x   Reagenzien Konzentration/50 µl Reaktion       Thermoprofil TaqMan® RT-PCR       (Stratagene): Schritt 1 45°C 30 min Schritt 2 95°C 10 min 50 Zyklen 95°C 60°C 15 sec 1 min Schritt 3 hold 4°C RNA x 10x Core RT-PCR buffer 1 x 20 mM dNTP mix 0,8 mM 50 mM MgCl2 5 mM Primer I 10 µM/ml 200 nM Primer II 10 µM/ml 200 nM Fluorogenic Probe 10 µM/ml 125 nM StrataScript RT 20 u/µl 1,25 U Sure Start™Taq DNA-Polymerase 5 U/µl; 500 U 2,5 U A.D. y-x

1. Mullis K.B., Faloona F.A.: „Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.“ Methods Enzymol. 155 (1987) 335-50.

2. Scharf S.J., Horn G.T., Erlich H.A.: „Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences.“ Science 233 (1986) 1076-8.

3. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J.: „Recent advances in the polymerase chain reaction.“ Science 252 (1991) 1643-51.

4. Gilliland G., Perrin S., Blanchard K., Bunn H.F.: „Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction.“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 2725-9.

5. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R.: „Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.“ Biotechnology (N Y) 10 (1992) 413-7.

6. Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R.: „Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions.“ Biotechnology (N Y) 11 (1993) 1026-30.