K. Grif 1, F. Allerberger 1, M.P. Dierich 1, A. Wimmer 2, H. Plicka 2
1 Institut für Hygiene und Sozialmedizin, Innsbruck
(Vorstand: o. Univ.-Prof. Dr. M.P. Dierich)
2 Amt für Wehrtechnik, Wien
(Leiter: Bgdr. R.F. Hofer)

• Schlüsselwörter
• Zusammenfassung
• Key-words
• Summary
• Einleitung
• Materialien und Methoden
• Ergebnisse
• Diskussion
• Literatur

Wenngleich man über die tatsächliche Relevanz des Bedrohungspotentials Bioterrorismus und biologische Kriegsführung unterschiedlicher Meinung sein kann, sollte das öffentliche Gesundheitswesen auf die Erfordernisse schwerer Infektionskrankheiten vorbereitet sein [1]. Am 4. Oktober 2001 wurde in Florida bei einem 63-jährigen Patienten Lungenmilzbrand festgestellt [2]. Da auch bei einem Arbeitskollegen und am Arbeitsplatz (America Media Incorporated, Boca Raton, Florida) des letztendlich Verstorbenen Bacillus anthracis nachgewiesen wurde, war von einem beabsichtigten Ausbringen von Sporen auszugehen. Am 12. Oktober 2001 wurde Hautmilzbrand bei einem Angestellen des Medienkonzerns ABS in New York festgestellt [3]. Wegen einer Hautläsion hatte er initial einen Infektiologen aufgesucht, welcher die Verdachtsdiagnose stellte. Die kulturelle Verifizierung der Diagnose wurde im Hinblick darauf, dass auch hier von einer absichtlichen Ausbringung von Milzbrandsporen auszugehen ist, behördlich bestätigt. Mit diesen Fällen wurde leider bewiesen, dass Bioterrorismus als mögliches Szenario grundsätzlich zu bedenken ist. Der Charakterisierung von B. anthracis-Isolaten zur Gewinnung von Rückschlüssen über die Herkunft der Bakterien kommt deshalb große Bedeutung zu. Wir beschreiben die Eignung von automatischer Ribotypisierung als Mittel zur Speciesidentifizierung und Subtypisierung bei B. anthracis.

Bakterienisolate
Fünf Bacillus anthracis-Isolate wurden getestet. Es handelte sich um drei Wildtypisolate von Anthrax-Fällen bei Rindern aus Tirol (B. anthracis 3520, 4675, 6782) [4], um den Impfstamm Sterne 34F2 (Onderstepoort Biological Products, Onderstepoort, Südafrika) und ein im Dezember 2001 aus einem Postsack amerikanischer Diplomatenpost gewonnenes Isolat („Bundesheer-Stamm“). Als Kontrollstämme wurden Bacillus cereus DSM 345 (= ATCC 11778) und ein an anderer Stelle näher beschriebener Bacillus megaterium-Stamm B13143 aus einer humanen Blutkultur verwendet [5].

Ribotypisierung
Automatische Ribotypisierung mittels RiboPrinter® (Qualicon, Wilmington, DE, USA) unter Verwendung von EcoRI, PvuII (Qualicon) und AseI (New England Biolabs GmbH, Frankfurt/Main) als Restriktionsenzyme erfolgte wie früher beschrieben [6]. Beim RiboPrinter-System wird gewissermaßen das gesamte rRNA-Operon und die angrenzenden Bereiche des Genoms in die Analyse einbezogen. Probenstämme werden über 18 h bei 35°C aerob auf Müller-Hinton-Agar (Oxoid, Basingstoke, UK) angezüchtet. Eine definierte Menge Bakterienkultur wird von der Agarplatte in ein Probengefäß übertragen und mit Puffer überschichtet. Nach zehnminütiger Hitzeinaktivierung werden die Zellen enzymatisch aufgebrochen. Die Bakterien-DNA wird durch spezifische Verdauungsenzyme geschnitten. Auf einem Gel werden die Fragmente nach Größe getrennt und direkt auf eine Membran überführt. Die rRNA-Gene werden mittels einer von 5,5 kb E. coli rrnB Operon-Sonde spezifisch detektiert. Auf der Basis von Chemolumineszenz entsteht ein Bandenmuster – das RiboPrint®-Pattern. Dieses Muster wird mittels eingebauter CCD-Kamera in digitalisierter Form festgehalten und vom Computer nach Normalisierung mit vorhandenen RiboPrint®-Patterns verglichen.

Abbildung 1 gibt die Ergebnisse der Ribotypisierung unter Verwendung von EcoRI als Restriktionsenzym wieder. Der automatische Vergleich der gewonnenen Banden-Muster mit Mustern in der Qualicon®-Datenbank erbrachte für das B. megaterium-Isolat B13143 eine korrekte Species-Diagnose. Die fünf B. anthracis-Isolate erbrachten ein einheitliches Bandenmuster, welches vom Gerät als B. cereus-Muster eingestuft wurde.
B. cereus DSM 345 (= ATCC 11778) wurde vom Gerät als Bacillus thuringiensis verkannt.

Abbildung 1: Automatische Ribotypisierung unter Verwendung von EcoRI als Restriktionsenzym. EcoRI-Ribotypisierung ermöglicht, B. megaterium und andere apathogene nicht-hämolysierende Bazillen von der B. anthracis/B.cereus-Gruppe zu differenzieren.

Abbildung 2 gibt die Ergebnisse der Ribotypisierung unter Verwendung von AseI als Restriktionsenzym wieder. Für das Genus Bacillus steht für dieses Restriktionsenzym derzeit keine Datenbank zur Verfügung. B. cereus DSM345 und B. megaterium B13143 erbrachten eigenständige, voneinander und von Bacillus anthracis zu unterscheidene Bandenmuster. Innerhalb der B. anthracis-Gruppe zeigten die drei Tiroler Isolate idente, charakteristische und von den zwei verbleibenden B. anthracis-Isolaten unterschiedliche Bandenmuster.

Abbildung 2: Automatische Ribotypisierung unter Verwendung von AseI als Restriktionsenzym. Die Bandenmuster der 3 Tiroler Wildstämme (3520, 4675, 6782) waren bei Verwendung von AseI voneinander nicht unterscheidbar, jedoch different von den Bandenmustern des Sterne-34F2-Stammes und dem im Dezember 2001 aus einem Postsack amerikanischer Diplomatenpost isolierten „Bundesheer-Stamm“. Das AseI-Bandenmuster der beiden letztgenannten Isolate unterscheidet sich zudem von dem für den Ames-Stamm publizierten Restriktionsmuster.

Abbildung 3 gibt die Ergebnisse der Ribotypisierung unter Verwendung von PvuII als Restriktionsenzym wieder. Für das Genus Bacillus steht für dieses Restriktionsenzym derzeit keine Datenbank zur Verfügung. B. cereus DSM345 und B. megaterium B13143 erbrachten eigenständige, voneinander und von B. anthracis zu unterscheidende Bandenmuster. Innerhalb der B. anthracis-Gruppe zeigten die drei Tiroler Isolate idente, charakteristische und von den zwei verbleibenden Anthrax-Isolaten unterschiedliche Bandenmuster.

Abbildung 3: Automatische Ribotypisierung unter Verwendung von PvuII als Restriktionsenzym. Die generierten Bandenmuster sind mit je 10 Banden komplexer als die Muster von AseI, was die Verwendung von PvuII für Subtypisierungen im Anschluss an Verwendung von AseI anbietet.

Bacillus anthracis ist eine genetisch sehr uniforme Bakterienspecies mit erstaunlich geringer Variabilität [7], was zwar molekulare Diagnostik erleichtert, eine Subtypisierung zur Gewinnung epidemiologischer Rückschlüsse jedoch erschwert. Phänotypisch lassen sich Isolate selbst unterschiedlichster geographischer Herkunft nicht differenzieren [8]. Die biochemischen und serologischen Methoden, die bei anderen Pathogenen zur Subtypisierung zum Einsatz kommen, haben, ebenso wie die Phagentypisierung, bei B. anthracis keinen Wert. Turnbull et al. postulierten, dass dieser exzeptionelle Species-Monomorphismus auf – im Vergleich zu allen anderen Species – relativ geringe Anzahl von Vermehrungszyklen zurückzuführen ist [8]. Vermehrungszyklen von B. anthracis hängen weitgehend von Tierinfektionen ab, wobei beträchtliche Zeitintervalle zwischen solchen Vorfällen liegen können. Da die Vermehrung praktisch ausschließlich im Tierkörper stattfindet, seien Vegetativformen von B. anthracis nur selten „Mutagenen, Phagen oder anderen Umwelteinflüssen, die Stammvariationen bewirken können“, ausgesetzt [8].

Somit bleiben bei dieser monomorphen Spezies lediglich molekulargenetische Subtypisierungsverfahren, welche in den letzten Jahren zunehmend verfeinert wurden [9, 10, 11, 12, 13]. Molekulargenetische Typisierungsverfahren, die auf der Variabilität der Anzahl von „tandem repeats“ in der variablen Region des vrrA-Gens basieren, gelten derzeit als Goldstandard: Sie gestatten es, alle derart getesteten Stämme dieser genetisch monomorphen Bakterienart in fünf Kategorien einzuordnen und somit Hinweise auf die jeweilige Herkunft von B. anthracis-Isolaten zu geben [14, 15].

Mittels automatisierter Ribotypisierung unter Verwendung von EcoRI ist es möglich, nicht hämolysierende Bazillen von der B. anthracis/B.cereus-Gruppe zu differenzieren [5]. Die Restriktionsenzyme AseI und PvuII erlauben zudem eine Subtypisierung verschiedener Anthrax-Isolate. Die publizierten Sequenzen der 16S und 23S rRNA-Gene von B. anthracis und B. cereus enthalten keine „restriction sites“ für AseI. Die 4 bis 5 Banden, alle über 5 kbp (Abbildung 3) reflektieren somit die Platzierung der ribosomalen Operons im Bacillus-Chromosom. AseI-Ribotypisierung bietet sich somit für eine erste Subtypisierung von B. anthracis an. Auch für PvuII enthalten die publizierten Sequenzen der 16S und 23S rRNA-Gene von B. anthracis und B. cereus keine Restriktionsstellen. Zudem sind die generierten Bandenmuster mit 10 Banden komplexer als die Muster von AseI, was die Verwendung von PvuII im Anschluss an die Subtypisierung mit AseI anbietet.
Die Bandenmuster der 3 Tiroler Wildstämme waren bei Verwendung von AseI und PvuII voneinander nicht unterscheidbar, jedoch klar different von den Bandenmustern des Sterne-34F2-Stammes und dem im Dezember 2001 aus einem Postsack amerikanischer Diplomatenpost isolierten „Bundesheer-Stamm“. Das AseI-Bandenmuster der beiden letztgenannten Isolate unterscheidet sich klar von den für den Ames-Stamm publizierten Restriktionsmustern [16, 17]. Dies würde den „Bundesheer-Stamm“ von dem in den Vereinigten Staaten im Rahmen von Bioterrorismus eingesetzten Ames-Stamm abtrennen. Das Vorkommen von einzelnen Sporen von B. anthracis als natürliche Kontamination ist in Geweben aus natürlichen Ursprungsmaterialen nicht ungewöhnlich [18].

Der Ausschluss der Species B. anthracis ist in der Veterinärmedizin und der Humanmedizin vor allem bei nicht-hämolysierenden Bacillus-Blutkulturisolaten erforderlich [19, 20]. Unsere Ergebnisse unterstreichen das beachtliche Potential von automatischer Ribotypisierung, welche im Bedarfsfall binnen weniger Stunden derartige Speciesbestimmungen ermöglicht. Zudem erlaubt die Ribotypisierung eine Subtypisierung von B. anthracis und somit epidemiologische Rückschlüsse über die Herkunft von Isolaten.

1. Allerberger F.: „Pest-Milzbrand-Tularämie.“ Antibiotika Monitor tom. XVII, 3/4 (1998) 4.

2. Bush L.M., Abrams B.H., Beall A., Johnson C.C.: „Index case of fatal inhalation anthrax due to Bioterrorism in the United States.“ N. Engl. J. Med. 345 (2001) 1607-1626.

3. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Update: public health message regarding anthrax. 12 October 2001 (htp://www.bt.cdc.gov/DocumentApp/Anthrax/
10122001Message)

4. Khaschabi D., Schönbauer M.: „Mikrobiologische Diagnostik von Milzbrand.“ Antibiotika Monitor tom. XIV, 3/4 (1998) 55-60.

5. Huemer H.P., Grif K., Allerberger F., Rotter M.: „Diagnostik und Typisierung von Bacillus anthracis mittels Rapid-PCR und Ribotyping.“ Antibiotika Monitor tom. XIV, 5/6 (2001) 105-108.

6. Grif K., Karch H., Schneider C., Daschner F., Beutin L., Cheasty T., Rowe B., Dierich M.P., Allerberger F.: „Comparative study of five different techniques for epidemiological typing of Escherichia coli O157.“ Diag. Microbiol. Infect. Dis. 32 (1998) 165-176.

7. Keim P., Kalif A., Schupp J., Hill K., Travis S.E., Richmond K., Adair D.M., Hugh-Jones M., Kuske C.R., Jackson P.: „Molecular evolution and diversity in Bacillus anthracis as detected by amplified fragment length polymorphism markers.“ J. Bacteriol. 179 (1997) 818-824.

8. Turnbull P.C.B.: „Guidelines for the Surveillance and Control of Anthrax in Humans and Animals.“ 3rd edition. WHO/EMZ/ZDI/98.6. (http://www.who.int/emc)

9. Henderson I.: „Fingerprinting Bacillus anthracis strains.“ Salisbury Med. Bull. 87, special suppl. (1996) 55-58.

10. Anderson G.L., Simchock J.M., Wilson K.H.: „Identification of a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species.“ J. Bacteriol. 178 (1996) 377-384.

11. Kaim P., Kalif A.S, Schupp J., et al.: „Molecular evolution and diversity of Bacillus anthracis as detected by amplified fragment length polymorphism markers.“ J. Bacteriol. 179 (1997) 818-824.

12. Jackson P.J., Walthers A., Kalif A.S., et al.: „Characterization of the variable-number tandem repeats in vrrA from different Bacillus anthracis isolates.“ Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 1400-1405.

13. Jackson P.J., Hugh-Jones M.E., Adair D.M., Green G., Hill K.K., Kuske C.R., Grinberg L.M., Abramova F.A., Keim P.: „PCR analysis of tissue samples from the 1979 Sverdlosk anthrax victims: the presence of multiple Bacillus anthracis strains in different victims.“ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 1224-1229.

14. Swartz M.: (2001) „Recognition and management of anthrax – an update.“ N. Engl. J. Med. 345 (2001) 1621-1625.

15. Keim P., Smith K.L., Keys C., Takahashi H., Kurata T., Kaufmann A.: „Molecular investigation of the Aum Shinrikyo anthrax release in Kameido, Japan.“ J. Clin. Microbiol. 39 (2001) 4566-4567.

16. Stroman D.W., McLeyan C, Rogers J.: „Discrimination between B. anthracis, B. cereus, B. mycoides and B. thuringiensis strains by automated rRNA operon ribotyping.“ Abstracts of the 98th general meeting of the American Society for Microbiology, ASM, Washington DC (1998) 2005-4171.

17. RiboPrint® pattern provided by Joel B. Hansen.

18. Pfisterer R.M.: „Epidemiologie und Klinik des Milzbrandes.“ Antibiotika Monitor tom. XIV, 3/4 (1998) 48-54.

19. Greenberg D.S.: „War, bioterrorism and the political landscape.“ Lancet 358 (2001) 2137.

20. Anonymus: „Interim European surveillance case definition for anthrax.“ Eurosurveillance Weekly 5: 011101 (2001). (http://www.eurosurv.org/2001/011101.htm)

Anschrift des Verfassers:
Ao. Univ.-Prof. Dr. Franz Allerberger
Institut für Hygiene und Sozialmedizin der Universität Innsbruck
A-6020 Innsbruck, Fritz-Pregl-Straße 3
E-Mail: franz.allerberger@uibk.ac.at

Danksagung:
Diese Arbeit wurde mit Unterstützung durch die European Commission (GENE project QLK2-2000-01404), den Jubiläumsfonds der Österreichischen Nationalbank (Projekt Nr. 9292) und das Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur ermöglicht.